Esistono due forme di m-calpaina: citoplasmatica e mitocondriale. La m-calpaina mitocondriale, formata da una subunità grande di 80 kDa e da una subunità piccola regolatoria di 30 kDa, assiste nei passaggi di espulsione della versione tronca del fattore AIF (Apoptosis Inducing Factor) dai mitocondri, interagendo con  la molecola mitocondriale VDAC (Voltage-dependent anion channel) e tagliandola. Il risultato è un poro formato da VDAC più il mediatore proapoptotico Bax attraverso cui può passare la forma tAIF (AIF troncato). La reazione di taglio su VDAC avviene ad una concentrazione di Ca²⁺ maggiore di quella necessaria per l’attivazione della μ-calpaina, già presente nel mitocondrio, con il compito di tagliare e produrre tAIF.(Ozaki et al., 2009). La versione citoplasmatica dell’enzima m-calpaina attiva la caspasi-12 che inizia il pathway apoptotico insieme ad AIF in cellule di topo (Sanges e Marigo, 2006).

La μ-calpaina è formata anch’essa da una subunità grande di 80 kDa, provvista di una sequenza segnale mitocondriale e da una subunità piccola, con funzione regolatoria, di 28 kDa e priva di sequenza segnale.

Figura 15. Modello di processamento di AIF e rilascio dal mitocondrio. Uno stimolo apoptotico conduce all’influsso di Ca2+ nel citosol. L’aumento prolungato di Ca2+ intracellulare conduce all’influsso di Ca2+ nel mitocondrio, provocando l’attivazione della μ-calpaina mitocondriale nello spazio intermembrana. La μ-calpaina mitocondriale attivata tronca e rilascia AIF dalla membrana interna mitocondriale allo spazio intermembrana. Un ulteriore aumento del livello mitocondriale di Ca2+ attiva la m-calpaina mitocondriale che provoca la troncatura del VDAC (Voltage-Dependent Anion Channel) e l’associazione della molecola proapoptotica Bax nella membrana esterna del mitocondrio dal citosol. Il tAIF viene poi rilasciato nel citosol attraverso pori formati da VDAC/Bax o Bax/Bax. (Ozaki et al., 2009)

Il Ca²⁺ entra nei mitocondri attraversando un canale indirizzato dal gradiente elettrochimico dei protoni. L’aumento della concentrazione di calcio intracellulare provocata dal malfunzionamento di PDE6β conduce al sovraccarico da Ca²⁺ mitocondriale. Il pathway più importante per l’estrusione del Ca²⁺ mitocondriale è quello che passa per il canale scambiatore Na⁺/Ca²⁺ (NCX). Secondo il modello proposto da Kar et al. (2009) NCX verrebbe proteolizzato da μ-calpaina quando la concentrazione di Ca²⁺ mitocondriale aumenta. Inoltre secondo il recente lavoro di Norberg et al. (2008) un aumento transiente della concentrazione di Ca²⁺ cellulare indotto da ATP non è condizione sufficiente per l’attivazione delle calpaine. Serve al contrario una concentrazione elevata di calcio che perduri nel tempo e non diminuisca rapidamente.

Il risultato dell’attivazione della μ-calpaina, è il taglio della proteina AIF tra Gly102 e Leu103, producendo la sua versione troncata tAIF. In forma di peptide appena sintetizzato AIF pesa 67 kDa ed è dotato di MLS (Mitochondrial Localization Signal): dopo l’entrata nel mitocondrio una peptidasi taglia il MLS e rilascia AIF in forma attiva del peso di 62 kDa. La proteina rimane comunque legata alla membrana interna mitocondriale per mezzo del suo estremo N-terminale. Dopo il taglio effettuato dalla μ-calpaina, tAIF pesa 57 kDa ed ha due sequenze segnale nucleari esposte. In origine la proteina consiste in 2 domini: un dominio redox attivo e un dominio proapoptotico. Quando non è impegnato come fattore apoptotico AIF ha un ruolo accessorio nel processo di fosforilazione ossidativa in atto nei mitocondri delle cellule funzionanti, grazie alla sua attività NADH ossidasi (Ozaki et al., 2009).

Dopo il processamento a tAIF, si può notare dalla Figura 15 come a tAIF venga permesso di uscire dai mitocondri per effetto dell’azione della m-calpaina mitocondriale, attiva solo ad alte concentrazioni di calcio (intorno a 1 mM), con la formazione del canale Bax/VDAC. Dopo l’uscita di tAIF dal mitocondrio esso viene traslocato nel nucleo per effetto delle sequenze segnale di cui è dotato, permettendo così l’inizio del processo di frammentazione del DNA (Ozaki et al., 2009).

Lo studio fatto nell’introduzione sui pathway che regolano la morte cellulare nei fotorecettori permette una migliore comprensione degli articoli che vi presento: il primo prende in esame un’ipotesi di terapia genica da effettuare per eliminare una qualsiasi mutazione nel gene della rodopsina, che potrebbe essere responsabile di una forma autosomica dominante di retinite pigmentosa; il secondo articolo dimostra invece come AIF sia la principale causa della degenerazione retinica nei topi rd1, portanti una mutazione nel gene PDE6B.

Figura 14. Pathway di trasduzione del segnale che porta alla morte cellulare di fotorecettori in topi rd1. (Sancho-Pelluz et al., 2008)

Il calcio è uno ione fondamentale nella fisiologia dei tessuti nervosi. Ha un ruolo di primo piano sia nelle cellule cardiache che in quelle nervose. I fotorecettori sono collegati a cellule nervose presenti nella retina. Queste cellule sono direttamente collegate al cervello per mezzo del nervo ottico. La trasmissione delle informazioni sfrutta gradienti di ioni calcio a cavallo delle membrane. Gli stessi ioni calcio però sono anche responsabili della segnalazione di eventuali malfunzionamenti a livello del reticolo endoplasmatico.

Il calcio ha quindi un ruolo principe sia nella funzione di alcune cellule sia nelle patologie che le possono interessare: nel nostro caso i fotorecettori. Così come il calcio è responsabile della trasmissione del segnale visivo, allo stesso modo una sua concentrazione troppo elevata può portare all’attivazione della morte cellulare. Anche modificazioni non letali nella concentrazione di calcio possono provocare alterazioni negative del metabolismo e della crescita di una cellula (Sancho-Pelluz et al., 2008).

E’ importante distinguere la concentrazione di calcio citoplasmatica da quella presente negli organelli, in particolare nei mitocondri. In una qualsiasi cellula a riposo la concentrazione di Calcio nel citoplasma ammonta a circa 100 nM, nel reticolo endoplasmatico è di circa 500 μM, e nei mitocondri si attesta intorno ai 100 nM, mentre la concentrazione extracellulare è circa 1 mM (Szabadkai e Duchen, 2008). Abbiamo visto in precedenza che la concentrazione di calcio è un mezzo fondamentale per la trasduzione del segnale nei fotorecettori: senza la variazione della [Ca²⁺] citoplasmatica il segnale visivo non potrebbe essere trasformato in segnale nervoso. La concentrazione del calcio varia nei fotorecettori tra i circa 300 nM (oscurità) e i 20 nM (luce) (Luo et al., 2008).

Quando però le molecole che controllano la trasduzione del segnale non funzionano nel modo corretto, possono provocare malfunzionamenti.

Come è possibile notare dalla Figura 14, il pathway della degenerazione nei fotorecettori inizia con una mutazione. Nel nostro caso, sono oggetto di studio i fotorecettori di topi rd1, che portano una mutazione nel gene PDE6B. La mancanza di una fosfodiesterasi funzionale impedisce al fotorecettore di limitare la concentrazione di nucleotidi ciclici cGMP, e l’innalzarsi della loro concentrazione provoca l’apertura dei canali CNG ed un significativo aumento della concentrazione di calcio intracellulare. Questo cambiamento fisiologico attiva una serie di pathway la cui dinamica nella degenerazione retinica non è al momento chiara e che portano alla morte cellulare, tra cui l’aumento della concentrazione di AMP ciclico e lo sviluppo di stress ossidativo che porta al danneggiamento del DNA.  E’ sicuro invece che la variazione citoplasmatica nella concentrazione di calcio causa una conseguente variazione della concentrazione di calcio anche nei mitocondri: essi iniziano ad assumere calcio dal citoplasma quando la sua concentrazione raggiunge circa 400 nM (Sancho-Pelluz et al., 2008; Szabadkai e Duchen, 2008). L’aumento della concentrazione di calcio mitocondriale provoca l’attivazione delle calpaine, con la traslocazione della flavoproteina AIF (Apoptosis Inducing Factor) dal mitocondrio al nucleo dei fotorecettori. AIF ha un ruolo primario nella frammentazione del DNA (Ozaki et al., 2009).

Figura 13. I pathway apoptotici mediate dallo stress nel reticolo endoplasmatico in varie cellule di topo. Tre pathway principali sono stati segnalati come importanti nella morte cellulare derivante da stress nel reticolo endoplasmatico: (1) il pathway apoptotico dipendente da caspasi-12; (2) il pathway ASK/JNK, che induce il rilascio del citocromo c dai mitocondri e l’attivazione della caspasi 9; (3) il pathway di Bap31 e caspasi 8, che induce anche il rilascio del citocromo c dai mitocondri e l’attivazione della caspasi 9. (Momoi, 2004)

Mentre risponde al pericolo dello stress che si è venuto ad instaurare nel reticolo endoplasmatico, la cellula allo stesso tempo si prepara alla sua morte programmata.

L’attivazione del pathway apoptotico avviene quando i segnali di stress perdurano nel tempo nonostante la sintesi dei chaperones. Il sensore dello stress, GRP78/BiP è localizzato nel reticolo endoplasmatico in condizioni di assenza di stress. L’aumento di proteine con folding scorretto come nel caso della rodopsina nei fotorecettori provoca il suo distacco dai recettori: con stress prolungato e se il proteasoma non riesce a degradare tutte le proteine,  viene attivata la risposta apoptotica. Nella Figura 13 si possono notare i tre pathway apoptotici conseguenza dello stress nel reticolo endoplasmatico. Lo stress eccessivo può arrivare ad attivare il pathway di JNK (cJun NH2-terminal kinase) e il pathway dipendente da caspasi-8, entrambi con rilascio del citocromo c e creazione dell’apoptosoma, oppure il pathway dipendente dalla caspasi-12 che nei fotorecettori di topo salta i passaggi intermedi e porta direttamente alla morte cellulare (Momoi, 2004).

Caspasi-12 di topo in assenza di stress si trova invece legata alla membrana del ER, sulla faccia citosolica. In presenza di un segnale di stress continuato l’enzima viene tagliato da parte delle calpaine, cisteina proteasi che verranno descritte più avanti. La caspasi-12 dopo essere stata processata dalla calpaina non assume subito la sua forma attiva di eterotetramero. Il taglio e l’oligomerizzazione possono essere assistiti da TRAF2 (TNF Receptor Associated Factor-2), richiamato in membrana per azione di IRE1α e coinvolto anche nel pathway di JNK (Momoi, 2004).

La morte cellulare nei fotorecettori non dipende come causa ultima dall’attivazione delle caspasi effettrici, ma la caspasi-8 può intervenire con la collaborazione della proteina BAP31 (B-cell receptor Associated Protein 31), coinvolta nel processo di rilascio del calcio dal lume del reticolo endoplasmatico e nell’entrata degli ioni Ca2+ nei mitocondri, e, come illustrato in Figura 13, con il processamento proteolitico della proteina Bid. Il pathway di JNK verrebbe a sua volta attivato dalla prolungata assenza di GRP78 dal recettore IRE1, portando allo stesso risultato derivante dall’azione della caspasi-8, cioè lo spostamento dei citocromi c dai mitocondri al citoplasma. I citocromi hanno un ruolo nell’attivazione dell’enzima caspasi-9, fondamentale per il taglio proteolitico che produce l’effettore caspasi-3 (Momoi, 2004).

E’ bene notare che, anche se i meccanismi di stress da folding scorretto possono attivarla, finora nei fotorecettori che presentano degenerazione retinica, è stata provata l’assenza di coinvolgimento della cascata caspasica nei meccanismi della morte cellulare (Sancho-Pelluz et al., 2008). E’ invece noto che una mutazione nel gene della rodopsina che porta al suo folding scorretto, porta alla degenerazione dei fotorecettori, ma non è ancora chiaro con quale meccanismo (Lin et al., 2007).

La comprensione dei meccanismi che portano alla morte cellulare dei fotorecettori è invece più avanzata nel caso di mutazioni che provochino alterazioni nella concentrazione intracellulare del calcio, come vedremo nel paragrafo successivo.

Figura 11. Struttura dei principali sensori dello stress nel reticolo endoplasmatico: IRE1, ATF6, PERK. Le barre arancioni rappresentano regioni sufficienti alla trasduzione del segnale di oligomerizzazione. Le barre blu rappresentano regioni di legame a BiP. Un box nero rappresenta il peptide segnale, mentre il box con strisce diagonali rappresenta le regioni di omologia tra IRE1 e PERK. Abbreviazioni: bZIP – leucine zipper, CX3C – dominio CX3CX3CX3C (pfam 02363), GLS 1 e 2 – Sequenze di localizzazione Golgi, TAD – Dominio di attivazione trascrizionale, TM – Dominio transmembrana. Le dimensioni non sono in scala. (Schröder et Kaufman, 2005)

La vita di una cellula, nel nostro caso di un fotorecettore, è regolata da equilibri molto ben definiti tra segnali di sopravvivenza e segnali di morte. Le variazioni di questo equilibrio possono rivelarsi decisive per il suo destino. Un errore nella sequenza aminoacidica di una proteina come la rodopsina, prodotta in elevatissima quantità nei fotorecettori, può diventare il punto di partenza di una serie di pathway apopotici. Le proteine appena sintetizzate risiedono nel Reticolo Endoplasmatico da cui poi vengono smistate verso le loro destinazioni cellulari, dopo il controllo del folding. Una proteina malfunzionante rimane sequestrata nel reticolo endoplasmatico, quindi un eccesso di proteine mal strutturate attiva la risposta da proteine con folding scorretto (Unfolded Protein Response). Questo tipo di risposta inizia con il riconoscimento del segnale di stress da parte di un recettore nel reticolo endoplasmatico, e prosegue con il blocco della sintesi proteica per permettere al proteasoma di eliminare l’eccesso di proteine, mentre viene stimolata la produzione di fattori di trascrizione. Essi prima permettono la sintesi di chaperones, poi preparano una eventuale risposta apoptotica. Se il proteasoma non dovesse riuscire a smaltire la proteina in eccesso, il risultato sarebbe infatti quello della morte cellulare programmata (Orrenius et al., 2003). Nel caso di un fotorecettore, la rodopsina è una proteina sintetizzata ad alto livello nei bastoncelli. Se la proteina non può assumere la sua forma corretta a causa di una mutazione, rimarrà sequestrata nel reticolo endoplasmatico, causando stress cellulare (Schröder e Kaufman, 2005).

Il segnale dello stress è di natura molecolare: un chaperone, GRP78 (glucose regulated protein), anche detto BiP (Binding Immunoglobulin Protein), presente nel reticolo endoplasmatico durante la sintesi delle proteine come visibile nella Figura 12, lega la parte luminale dei recettori per lo stress. L’affinità del legame con i recettori è comunque bassa. GRP78 è in grado di legarsi alle proteine nascenti, favorendone il folding e se è legato a un recettore ne impedisce l’attivazione: ciò significa che in caso di aumento di concentrazione delle proteine con folding scorretto nel reticolo endoplasmatico di un fotorecettore, i chaperones tenderanno a legarsi con maggiore frequenza alle proteine appena sintetizzate, e molto meno ai recettori. Come si vede nella Figura 12, la presenza di tante proteine non foldate correttamente può causare il rilascio dei GRP78: i recettori per lo stress saranno quindi liberi di attivarsi (Benjamin, 2006).

Le proteine designate per il riconoscimento dei segnali di stress provenienti dal reticolo endoplasmatico sono quelle segnalate nella Figura 11: IRE1α (Inositol Requiring Kinase 1), ATF6 (Activation of Transcription Factor 6) e PERK (PKR-like Endoplasmic Reticulum Kinase). IRE1α è una proteina transmembrana, presente nell’uomo in due isoforme, α e β: la forma α è quella generalmente presente in tutti i tessuti. L’attivazione di IRE1α avviene quando le proteine ancora in fase di folding sono presenti in numero tanto alto da impedire il legame di BiP al suo dominio luminale. L’attivazione avviene con un cambiamento conformazionale e l’oligomerizzazione. L’accoppiamento dei recettori permette una reazione di transautofosforilazione ad opera dei domini chinasici e la successiva attivazione del dominio endonucleasico, in grado di tagliare un mRNA codificante per un fattore di trascrizione. Tale fattore è chiamato XBP1 (X-box protein 1) e dal suo mRNA IRE1α excide un tratto di 26 basi: dopo la sintesi della proteina, XBP1 è in grado di entrare nel nucleo e attivare la trascrizione di geni selezionati. In Drosophila l’attivazione di XBP1 protegge i fotorecettori dallo stress da eccesso di rodopsina, (Ryoo et al., 2007).

Figura 12. La figura descrive la risposta da stress nel reticolo endoplasmatico. Il taglio proteolitico di ATF6 in risposta allo stress nel reticolo endoplasmatico conduce alla regolazione positiva della sintesi di chaperones come GRP78 (già presente nel reticolo endoplasmico) e GRP94 e del mRNA XBP1. La priorità data ai segnali dipendenti dalla proteina ATF6 precede l’intervento di XBP1 e indica un certo controllo su come i segnali di stress vengono gestiti nel reticolo endoplasmico. La figura descrive inoltre gli effetti dello stress di tipo ischemico, caratteristica peculiare alle cellule nervose, che a sua volta porta allo stress nel reticolo endoplasmatico. (Benjamin, 2006)

ATF6 è presente esclusivamente nei mammiferi ed è una proteina transmembrana. Dopo la manifestazione dello stress nel ER le proteasi S1P e S2P tagliano ATF6 liberando un fattore di trascrizione da 50 kDa che entra nel nucleo stimolando la sintesi di chaperones, che hanno il compito di ritardare il più possibile il ricorso alla fase di apoptosi. Come si vede nella Figura 12, l’azione di ATF6 tagliato produce un effetto diretto sul reticolo endoplasmatico, aumentando la sintesi anche del chaperone GRP78 (Schröder e Kaufman, 2005).

Anche il recettore PERK ha un dominio luminale omologo a quello di IRE1, come evidenziato dalle strisce oblique nella struttura di Figura 11, ma il suo dominio citosolico ha funzione differente: esso è infatti specifico per il fattore eIF2α, coinvolto nella costruzione della subunità ribosomica 80S, indispensabile per le operazioni di traduzione da mRNA a proteine. La fosforilazione di eIF2α (sul residuo Ser51) impedisce la prosecuzione normale delle operazioni di traduzione. La Figura 12 dimostra come d’altro canto eIF2α fosforilato attivi la traduzione di fattori di trascrizione come ATF4 che promuovono la sintesi di proteine che limitano lo stress ambientale, ed al tempo stesso in un meccanismo a feedback impediscono il protrarsi nel tempo dell’attenuazione della traduzione, intervenendo su eIF2α (Schröder e Kaufman, 2005).

Il risultato netto della risposta primaria di IRE1α, ATF6 e PERK è la sintesi di chaperones, e lo stallo in fase G1 delle cellule: questo avviene per permettere il refolding delle proteine in eccesso o l’eliminazione delle stesse ad opera del proteasoma. Se però per qualsiasi motivo il refolding non può avvenire o il proteasoma non è in grado di degradare tutte le proteine malfunzionanti, l’unica strada possibile per la cellula rimane quella della morte programmata (Schröder e Kaufman, 2005). In un fotorecettore la cui rodopsina è mutata succede proprio questo: la rodopsina è una proteina sintetizzata a livelli così alti che il proteasoma non riesce a degradarne una quantità adatta a fare diminuire lo stress cellulare, portando così all’apoptosi.

Il Death Domain è membro delle famiglie dei recettori TNF e ha 2 sottodomini di funzioni diverse composti da α-eliche anfipatiche: DED (Death Effector Domain) e CARD (Caspase Recruitment Domain). La funzione di questi domini è il reclutamento delle caspasi iniziatrici nel luogo di formazione dei complessi proapoptotici. Il prodominio caspasico può essere lungo (>90 aa) o corto (20-30 aa). Le caspasi con prodominio lungo sono divise in due gruppi: caspasi-1, 4, 5, 12, 13, 14 controllano la maturazione delle citochine e i processi infiammatori; caspasi-2, 8, 9, 10 sono dette iniziatori dell’apoptosi e contengono dominio DED (caspasi-8 e 10) o dominio CARD (caspasi-2 e 9). Il dominio CARD è contenuto anche nelle caspasi-1, 4, 5, 11, 12. Al contrario le caspasi con dominio corto sono dette effettori o esecutori dell’apoptosi e sono le caspasi-3, 6, 7 (Chowdury et al, 2008).

Ogni enzima caspasi è una cisteina proteasi che taglia in corrispondenza di un residuo di Aspartato. Il sito catalitico conservato ha sequenza consenso QACxG, la cui localizzazione è visibile nella Figura 10, all’interno della subunità α. I tagli proteolitici necessari la attivazione di una caspasi avvengono in siti dotati di un residuo Asp a denotare la possibilità di amplificazione del segnale data dall’attivazione di più caspasi effettrici ad opera di poche caspasi iniziatrici. Ogni caspasi rappresenta un eterodimero di un omodimero [p20₂-p10₂] legati in una struttura quaternaria. Ogni monomero p20-p10 forma un cilindro con un foglietto β centrale formato da 6 strand. I due cilindri interagiscono tra loro testa-coda, e quindi con i siti attivi posizionati agli opposti estremi della molecola. Le caspasi sono quindi generalmente responsabili del processo di inizio ed esecuzione dell’apoptosi (Chowdury et al, 2008).

Se l’apoptosi è alla base del malfunzionamento della retina in pazienti malati di retinite pigmentosa, in che modo le mutazioni coinvolte nella patologia sono alla base della sua manifestazione ? Descriverò due pathway, uno causato da una mutazione in rodopsina, che causa una risposta intrinseca e apoptosi. Nel secondo pathway invece descriverò come una mutazione che porta ad una concentrazione di calcio errata nei fotorecettori possa causare l’attivazione di un pathway, intrinseco anch’esso, caspasi-indipendente ed attivato dalle proteasi chiamate calpaine: l’effettore di questo pathway è stato identificato in una molecola mitocondriale.

Figura 9. I pathway apoptotici. Il pathway estrinseco mediato da recettori. La ligazione dei recettori apoptotici è seguita dalla formazione del complesso di segnalazione di morte inducibile (DISC), che risulta nell’attivazione della caspasi-8 e quindi della caspasi-3, che porta all’apoptosi, oppure al taglio di Bid mediato sempre dalla caspasi-8. A sua volta la forma tronca di BID induce la traslocazione dei fattori apoptotici Bax/Bak sulla membrana mitocondriale. Questo provoca il rilascio di molecole dall’interno dei mitocondri, in particolare di citocromo c, che partecipa al complesso dell’apoptosoma insieme ad Apaf-1 (Apoptosis Activating Factor 1) e proCaspasi-9. L’attivazione della caspasi-9 porta al processamento della caspasi-3. Il pathway intrinseco mediato da mitocondri. I segnali di morte intervengono in modo diretto o indiretto sui mitocondri, risultando anche in questo caso nella formazione del complesso dell’apoptosoma. Nel processo sono coinvolte le proteine della famiglia Bcl-2 (regolazione del rilascio del citocromo c), le proteine di inibizione dell’apoptosi (IAP), e il secondo attivatore mitocondriale di caspasi (SMAC). Il pathway intrinseco funziona anche con meccanismi indipendenti da caspasi, che coinvolgono il rilascio dai mitocondri e la traslocazione nel nucleo di almeno due proteine: il fattore che induce l’apoptosi (Apoptosis Inducing Factor - AIF) e l’Endonucleasi G. Il ruolo di AIF come mediatore dell’apoptosi con condensazione della cromatina e comparsa di frammenti di cromatina ad alto peso molecolare è conosciuto, invece la funzione dell’endonucleasi non lo è ancora. Pathway dipendente da Caspasi-2. L’apoptosi da danni al DNA è provocata dall’attivazione di caspasi-2, che stimola la formazione dell’apoptosoma, con un meccanismo al momento non conosciuto. Pathway mediato da Granzyme-A (GrA). Questo pathway è stato descritto da poco: l’entrata di GrA nel citosol della cellula è controllato da pori creati da perforina, attivati dal Calcio. La endonucleasi GAAD (GrA activated DNase) coinvolta in questo meccanismo crea nick a singola elica nel DNA. (Orrenius et al., 2003)

L’apoptosi è il processo di suicidio cellulare: coinvolge tutti i meccanismi che portano alla morte controllata di una cellula. La Figura 9 dimostra come l’apoptosi possa essere iniziata da segnali esterni o interni alla cellula: i segnali esterni vengono intercettati da recettori di membrana con il ruolo di iniziatore del pathway preso dalla caspasi-8; i segnali interni sono di due tipi: il danno al DNA che porta all’apoptosi mediata da caspasi-2 o lo stress cellulare segnalato ai mitocondri con formazione dell’apoptosoma. Nella figura è anche mostrato un meccanismo caspasi-indipendente causato dall’apertura di un poro nella membrana.  Nel caso di segnali esterni la cellula è capace di riconoscere un segnale come pericoloso, attivando così un pathway di trasduzione del segnale che porta al suo suicidio programmato. I segnali interni invece sono riconosciuti da proteine che controllano lo stato della cellula: quando tali proteine riconoscono che il sistema ha raggiunto il punto di non ritorno, viene attivata la risposta apoptotica. In questo caso giocano un ruolo importante nell’origine della risposta anche gli organelli cellulari, i mitocondri e il reticolo endoplasmatico (Orrenius et al., 2003).

Una cellula in fase di apoptosi è riconoscibile per via della forma assunta dalla sua membrana plasmatica, che subisce il processo cosiddetto di “blebbing” ossia la formazione di protrusioni della membrana e dalla condensazione nucleare e citoplasmatica. Altro passaggio fondamentale è la formazione dei corpi apoptotici, strutture membranose chiuse, pronte per essere raccolte da cellule circostanti o da macrofagi. La necrosi al contrario è il processo di rigonfiamento continuo della cellula, con la rottura della membrana plasmatica e la fuoriuscita del citoplasma nello spazio extracellulare. Si  liberano così componenti cellulari nocivi, che provocano infiammazione e risposta del sistema immunitario. La risposta finale di una reazione di apoptosi è generalmente l’attivazione di proteasi chiamate caspasi o calpaine. (Orrenius et al., 2003).

Io continuo a votare e credere nel PD perchè lo intendo come una sfida. Come una sfida che si propone di permettere l’incontro di idee e culture diverse.

La sinistra deve avere come obiettivo il riconoscimento delle diversità come un punto di forza e non come debolezza. Quale esempio migliore c’è del farlo ritrovandosi in un partito che ha la forza di riconoscere le diverse opinioni, e di definire una politica che sia l’incontro di tali diversità? E’ vero che il PD non è certo stato un esempio di chiarezza negli ultimi tempi: io però ritengo che questi li si possa considerare semplicemente dei malanni che precedono la crescita. Unire due partiti e far finta che nulla fosse successo (tipo l’incapacità di rinunciare alla targa con la scritta “Margherita” all’uscita di una sede del PD) non poteva essere l’idea giusta da portare avanti, come d’altro canto rispettare a tal punto tutte le idee da dare l’impressione di non fare delle scelte (“ma anche”, ricordate ?).

Il lavoro che è stato portato avanti negli ultimi mesi in Assemblea nazionale con la stesura del programma ha invece permesso un percorso iniziale di ricerca della sintesi tra le posizioni diverse presenti nel partito, che non è affatto stato completato, ma riesce a dare un’immagine ancora parziale ma sicuramente più definita di quella precedente. Sicuramente uno dei punti (il più importante secondo me) in cui la sintesi manca ancora è quello delle politiche sul lavoro. Lì secondo me il PD ancora non riesce a trovare gli elementi di sintesi necessari alla comunicazione verso l’esterno, e finchè non ci riuscirà la sua vita sarà molto difficile.

Rimango comunque convinto del fatto che l’aspetto più stimolante del Partito Democratico sia la sua pretesa di essere un punto di incontro (scontro ?) di idee diverse, e che a questo incontro non si debba rinunciare. La rinuncia all’incontro e allo sforzo di trovare un punto comune tra le idee diverse rischia di generare solo altri facili frazionamenti. Facili perchè si rinuncia al confronto dialettico solo per ritrovarsi con le persone che bene o male la pensano esattamente come noi. Il risultato finale però è solo quello di rinchiudersi in un recinto più piccolo di quello precedente.

Io invece voglio sfidare ed essere sfidato al pensiero “out of the box”, fuori dalla scatola e dal recinto autoimposto dalle mie stesse convinzioni. Perchè solo così si cresce sul serio.

Figura 8. Malattie dei fotorecettori trasmesse da bastoncelli a coni. Le patologie sono stazionarie o progressive. Le mutazioni in diversi geni causano pa-tologie che sono dominanti, recessive o legate al cromosoma X. Nelle forme sindromiche, la retinite avviene insieme con sintomi di patologie in tessuti o organi non oculari. I geni sono indicati dalle rispettive sigle. (Berger et al., 2010)

Il termine retinite pigmentosa si riferisce ad un gruppo di patologie con fenotipi simili e cause genetiche eterogenee. Generalmente queste patologie sono caratterizzate dalla perdita progressiva della vista, con inizio e velocità della progressione molto diversificate anche all’interno di una singola famiglia. La malattia inizia con la perdita della visione notturna, seguita da una progressiva perdita della visione nell’area medio-periferica del campo visivo. La progressione porta alla cosiddetta visione a tunnel ed infine alla perdita totale della vista (Hartong et al., 2006).

Il sistema fotorecettoriale più colpito è quello dei bastoncelli, coinvolti nella visione notturna e presenti in frequenza più alta nelle aree periferiche del campo visivo. Nelle fasi più avanzate della patologia sono interessati anche i coni, anche se con un meccanismo al momento sconosciuto. I fotorecettori ammalati vanno incontro ad apoptosi: il ritmo della perdita di fotorecettori si può notare dall’assottigliarsi del ONL (Outer Nuclear Layer), lo strato retinico che contiene i fotorecettori, e dall’accumulo di pigmento (rodopsina) sulla retina. Ai coni è demandata la visione diurna e in dettaglio. I coni sono concentrati per lo più nella macula, cioè nella parte centrale del campo visivo. Si può supporre in via generale che la semplice presenza dei bastoncelli fornisca i segnali di sopravvivenza necessari a mantenere “in vita” i coni (Hartong et al., 2006).

La retinite compare nella popolazione con un rapporto di un caso ogni 3500-4000 individui sani. Il primo gene collegato al fenotipo RP venne scoperto ventisei anni fa sul cromosoma X. Da allora più di 40 geni sono stati messi in relazione con la patologia (Hartong et al., 2006). Le mutazioni da cui la retinite viene causata possono essere autosomiche recessive, dominanti o legate al cromosoma X. Nella maggior parte dei casi (50-60%) le mutazioni sono autosomiche recessive, seguite in probabilità da quelle dominanti (30-40%) e legate al cromosoma X (5-20%) (Hartong et al., 2006).

RHO, il gene per la rodopsina, è uno tra i geni più associati alla retinite pigmentosa. Mutazioni nel gene RHO provocano generalmente un fenotipo autosomico dominante, con effetto dominante negativo sul funzionamento del fotorecettore. E’ possibile per esempio che l’accumularsi di proteine con folding errato nel reticolo endoplasmatico porti all’attivazione dei pathway apoptotici (Hartong et al., 2006). E’ infatti generalmente riconosciuto che la causa principale della perdita di capacità visive dovuto a retinite pigmentosa sta nel processo dell’apoptosi. Nella Figura 8 si possono osservare tutti i geni messi in relazione con l’insorgere della malattia. I geni del ciclo della visione, se mutati nei bastoncelli provocherebbero la perdita di visione notturna fin  dalla nascita, e la susseguente morte dei fotorecettori a causa dello squilibrio nella fisiologia delle cellule fotorecettoriali causato dalle proteine mal funzionanti. Prendendo ad esempio una mutazione nel gene PDE6A o PDE6B si otterrebbe un enzima fosfodiesterasi difettivo. Non essendo la fosfodiesterasi in grado di tagliare il cGMP ne permetterebbe l’aumento di concentrazione. L’aumento di [cGMP]_c aumenterebbe la conduttanza del CNG (Cyclic-Nucleotide-gated Channel) permettendo un aumento del flusso di ioni Ca²⁺ nella cellula. L’innalzamento della [Ca²⁺] provocherebbe l’attivazione dei pathway apoptotici ad essa associati (Hartong et al., 2006).

Figura 7. Meccanismi della fototransduzione nei bastoncelli. (A) Schema dei pathway di reazione nel segmento esterno dei bastoncelli (ROS). GCAP = guanylate-cyclase activating protein; hν = fotone; Rh = rodopsina; Rh* = rodopsina foto-attivata; Rh*~P = rodopsina fosforilata; complesso GAP (GTP-ase activating protein). + = stimolazione o modulazione positiva; - = inibizione o modulazione negativa. (B) Il diagramma di flusso descrive la sequenza di eventi attivata dalla luce nella fototransduzione. (Luo et al., 2008)

La risposta alla stimolazione garantita dai fotoni deve essere trasformata velocemente in un segnale nervoso, ma al tempo stesso la trasduzione del segnale deve essere interrotta. L’eccesso di segnale e un aumento troppo duraturo della concentrazione di Ca²⁺ potrebbe infatti portare all’apoptosi del fotorecettore (Sancho-Pelluz et al., 2008). Per far fronte a questo problema, la cellula è dotata di sistemi di recupero o sistemi a feedback con il compito di riportare il fotorecettore allo stato di riposo. Questi sistemi coinvolgono tutti i partecipanti al pathway di trasduzione del segnale: rodopsina, transducina, PDE6, il livello di cGMP presente nel segmento esterno, i canali CNG. Il ruolo principe nel meccanismo di recupero feedback è dato dal livello intracellulare di calcio (Luo et al., 2008).

La rodopsina una volta raggiunto lo stato di Metarodopsina II rimarrebbe a lungo in condizioni attivate se non intervenisse l’enzima Rodopsina Chinasi (GRK1). Tale enzima fosforila la rodopsina all’interno di una sequenza C-terminale di 15 residui. Essa è dotata di numerosi aminoacidi fosforilabili. Gli eventi di fosforilazione devono essere multipli (almeno tre) per garantire l’inattivazione dell’enzima (Mendez A et al. 2000). L’attività di GRK1 a sua volta è controllata dall’enzima recoverina, proteina che lega il calcio (Luo et al., 2008). L’alta concentrazione di calcio al buio spinge l’equilibrio verso il legame con la recoverina, che così diventa in grado di inibire l’azione della chinasi. Al contrario la luce provoca una diminuzione del calcio intracellulare, provocando il processo inverso. Il calcio si stacca dalla recoverina, che perde così la capacità di inibizione, liberando e attivando GRK1. La fosforilazione di rodopsina ne pregiudica in larga parte l’attività, comunque presente anche se a livelli molto bassi. Il legame dell’arrestina, che ha affinità per la rodopsina fosforilata, cancella totalmente il residuo di attività del G-coupled receptor (Luo et al., 2008).

Il passaggio successivo per il recupero del fotorecettore è quello che coinvolge la proteina G transducina in forma attivata e quindi legata all’inibitore PDE6γ. Il distacco della transducina si realizza solo con la reazione di idrolisi di ATP ad ADP. Questa reazione viene accelerata dal complesso GAP (GTPase Activating Protein), composto da 3 subunità: RGS9-1 (Regulator of G-protein Signaling) con l’attività GAP vera e propria, stabilizzata dai fattori Gβ5-L e R9AP (RGS9 Anchor Protein), quest’ultimo con funzione di ancoraggio alla membrana. Inoltre PDE6γ accelera l’attività del complesso GAP su transducina (Fu e Yau, 2007), garantendo che la maggior parte dell’attività di inibizione avvenga solo dopo che PDE6α e PDE6β siano state effettivamente liberate e rese in grado di idrolizzare il cGMP. Questo è il passaggio limitante della fase di recupero del fotorecettore e non coinvolge il Ca²⁺ (Krispel CM et al., 2006).

La concentrazione del Calcio dopo la terminazione del pathway torna ai livelli precedenti il segnale visivo: circa 250 nM. Il cGMP viene prodotto dagli enzimi Guanilato Ciclasi (GC), proteine transmembrana ancorate alla membrana dei dischi. Per esempio, sono presenti nella retina di topo in 2 forme: Ret-GC1 e Ret-GC2. A loro volta questi enzimi sono regolati da proteine leganti il calcio, GCAP (Guanylate Cyclase Activating Protein). Come si può osservare in Figura 7° e B, le GCAP legano il Calcio quando è presente in soluzione, ma vengono attivate quando la concentrazione dello ione diminuisce, stimolando la sintesi del cGMP da parte delle GC. Nella regolazione, GRK1 e GCAP hanno ruoli diversi: GRK1 interviene nel caso di illuminazione ad alta intensità mentre quando l’intensità della luce è media o limitata, diventa più importante il livello di cGMP e quindi il lavoro delle GCAP (Luo et al., 2008).

Figura 6. La cascata di fototransduzione. Rappresentazione della cascata di fototransduzione nei bastoncelli.. Nello stato “dark” i canali da cGMP sono aperti, permettendo l’entrata di ioni e la depolarizzazione delle cellule. Quando l’opsina è colpita dalla luce, il retinoide legato cambia conformazione (i), la transducina è attivata dall’opsina e la subunità α si stacca dal complesso βγ (ii). La α-transducina attiva la cGMP-fosfodiesterasi (PDE) provocando il rilascio delle due subunità PDEγ dal complesso PDEαβ. PDE idrolizza cGMP (ii); il decremento nella concentrazione di cGMP chiude i canali-cGMP e la cellula iperpo-larizza (iii), promuovendo un segnale passato poi ai neuroni della retina interna. In relazione con la continua attività degli scambiatori Na+-Ca2+ (iii), la concentrazione di calcio scende e il calcio stesso viene rilasciato dalla proteina recoverina, attivandola (iv). La recoverina attiva la rodopsina chinasi, che fosforila (P) l’opsina, mentre l’arrestina riporta l’opsina allo stato inattivo. La concentrazione di calcio più bassa causa anche il rilascio del calcio dalle “proteine attivanti la guanilato ciclasi” (GCAP), che attivano a loro volta la guanilato ciclasi (RetGC) (v). La guanilato ciclasi aumenta la concentrazione di cGMP, che permette l’apertura del canali-cGMP, permettendo l’afflusso di ioni, incluso Ca2+, depolarizzando così la cellula e ritornando allo stato “dark”. (Smith et al., 2009)

L’attivazione della fosfodiesterasi provoca un’immediata diminuzione dei livelli intracellulari di cGMP. La diminuzione della concentrazione di cGMP provoca la chiusura dei canali CNG (“cyclic-nucleotide-gated”). I canali CNG permettono l’entrata nella cellula di ioni Ca²⁺, la cui concentrazione si trova tra i 300 e i 500 nM. La concentrazione non può essere superiore, per il rischio che provochi apoptosi. Inoltre rimane in equilibrio per effetto dell’azione degli scambiatori di membrana Na⁺/ Ca²⁺, K⁺ (NCKX, “Na-Ca-K-exchanger” ), sintetizzati esclusivamente nel segmento esterno (Luo et al., 2008). La stechiometria dello scambio effettuato dalle proteine di trasporto è la seguente: un atomo di Calcio in uscita dal fotorecettore insieme ad uno di Potassio, con 4 atomi di Sodio in entrata (Krizaj and Copenaghen, 2007). I canali CNG quando sono aperti fanno trasporto passivo, mentre gli NCKX fanno trasporto attivo contro gradiente (Luo et al., 2008).

In condizioni di buio ogni fotorecettore è depolarizzato. In condizioni di illuminazione, il fotorecettore riceve il segnale sotto forma di fotone e interviene sulla concentrazione del secondo messaggero cGMP, che diminuendo si stacca dal canale. Come si può notare in Figura 6/(iii) il canale di conseguenza si chiude impedendo l’entrata a Ca²⁺ e la continua depolarizzazione del recettore. Al contrario la chiusura dei canali CNG provoca la iperpolarizzazione del recettore, e questa da luogo al segnale nervoso riconoscibile dalle cellule gangliari (Berg et. al, Biochimica).

Il funzionamento della trasmissione del segnale nei fotorecettori è peculiare e differente da quello dei neuroni. Nei neuroni la risposta avviene nei confronti di potenziali d’azione mediati da depolarizzazione. Invece nei fotorecettori l’iperpolarizzazione provoca la risposta a un potenziale di membrana che può avere variazioni graduali: questo permette all’occhio di percepire segnali visivi di intensità differenti (Berg et. al, Biochimica).

I canali CNG sono costituiti da 4 subunità sintetizzate a partire dai geni CNG. I geni CNG codificano per i peptidi costituenti canali presenti nei bastoncelli, nei coni e nelle cellule del sistema uditivo: sono chiamati CNGA numerati da 1 a 4 e CNGB1 e CNGB3. Nei bastoncelli sono espresse le forme di CNGA1 e CNGB1. La forma espressa da CNGA1 tende a trimerizzare grazie a sequenze C-terminali “leucine-zipper-like”, formate da 2 coiled coil. La sequenza è composta dal dominio leucine-zipper-like (22aa) più i 27 aminoacidi downstream (Zhong et al., 2002). Ne consegue quindi che il canale CNG stesso è un eterotrimero non simmetrico, formato da 3 subunità CNGA1 più una singola CNGB1. Ciascuna subunità è composta da 6 eliche transmembrana, con le eliche 5 e 6 che formano il poro vero e proprio. Sia l’N-terminale che il C-terminale sono intracellulari, con il CNBD (cyclic nucleotide binding domain) al C-terminale, qualche residuo aminoacidico dopo l’elica 6. L’N-terminale della subunità CNGB1 è dotata di un dominio ricco di proline (GARP). Questo dominio interagisce con il complesso periferina-2 nella membrana dei dischi presenti nel segmento esterno: CNGB1 potrebbe avere un ruolo strutturale per il mantenimento della forma peculiare dei bastoncelli (Higgins et al., 2002).