Dalla variazione della concentrazione di calcio alla frammentazione della cromatina

Gli enzimi responsabili dell’attivazione di AIF sono le cisteina proteasi chiamate calpaine. Le due forme più comuni di calpaina sono presenti in forma ubiquitaria, in tutti i tessuti: μ-calpaina e m-calpaina. La loro attivazione nei mitocondri richiede per la prima concentrazioni di circa 50 μM di Ca²⁺, mentre la seconda richiede concentrazioni circa 0.2-1 mM.

Esistono due forme di m-calpaina: citoplasmatica e mitocondriale. La m-calpaina mitocondriale, formata da una subunità grande di 80 kDa e da una subunità piccola regolatoria di 30 kDa, assiste nei passaggi di espulsione della versione tronca del fattore AIF (Apoptosis Inducing Factor) dai mitocondri, interagendo con  la molecola mitocondriale VDAC (Voltage-dependent anion channel) e tagliandola. Il risultato è un poro formato da VDAC più il mediatore proapoptotico Bax attraverso cui può passare la forma tAIF (AIF troncato). La reazione di taglio su VDAC avviene ad una concentrazione di Ca²⁺ maggiore di quella necessaria per l’attivazione della μ-calpaina, già presente nel mitocondrio, con il compito di tagliare e produrre tAIF.(Ozaki et al., 2009). La versione citoplasmatica dell’enzima m-calpaina attiva la caspasi-12 che inizia il pathway apoptotico insieme ad AIF in cellule di topo (Sanges e Marigo, 2006).

La μ-calpaina è formata anch’essa da una subunità grande di 80 kDa, provvista di una sequenza segnale mitocondriale e da una subunità piccola, con funzione regolatoria, di 28 kDa e priva di sequenza segnale.

Figura 15. Modello di processamento di AIF e rilascio dal mitocondrio. Uno stimolo apoptotico conduce all’influsso di Ca2+ nel citosol. L’aumento prolungato di Ca2+ intracellulare conduce all’influsso di Ca2+ nel mitocondrio, provocando l’attivazione della μ-calpaina mitocondriale nello spazio intermembrana. La μ-calpaina mitocondriale attivata tronca e rilascia AIF dalla membrana interna mitocondriale allo spazio intermembrana. Un ulteriore aumento del livello mitocondriale di Ca2+ attiva la m-calpaina mitocondriale che provoca la troncatura del VDAC (Voltage-Dependent Anion Channel) e l’associazione della molecola proapoptotica Bax nella membrana esterna del mitocondrio dal citosol. Il tAIF viene poi rilasciato nel citosol attraverso pori formati da VDAC/Bax o Bax/Bax. (Ozaki et al., 2009)

Il Ca²⁺ entra nei mitocondri attraversando un canale indirizzato dal gradiente elettrochimico dei protoni. L’aumento della concentrazione di calcio intracellulare provocata dal malfunzionamento di PDE6β conduce al sovraccarico da Ca²⁺ mitocondriale. Il pathway più importante per l’estrusione del Ca²⁺ mitocondriale è quello che passa per il canale scambiatore Na⁺/Ca²⁺ (NCX). Secondo il modello proposto da Kar et al. (2009) NCX verrebbe proteolizzato da μ-calpaina quando la concentrazione di Ca²⁺ mitocondriale aumenta. Inoltre secondo il recente lavoro di Norberg et al. (2008) un aumento transiente della concentrazione di Ca²⁺ cellulare indotto da ATP non è condizione sufficiente per l’attivazione delle calpaine. Serve al contrario una concentrazione elevata di calcio che perduri nel tempo e non diminuisca rapidamente.

Il risultato dell’attivazione della μ-calpaina, è il taglio della proteina AIF tra Gly102 e Leu103, producendo la sua versione troncata tAIF. In forma di peptide appena sintetizzato AIF pesa 67 kDa ed è dotato di MLS (Mitochondrial Localization Signal): dopo l’entrata nel mitocondrio una peptidasi taglia il MLS e rilascia AIF in forma attiva del peso di 62 kDa. La proteina rimane comunque legata alla membrana interna mitocondriale per mezzo del suo estremo N-terminale. Dopo il taglio effettuato dalla μ-calpaina, tAIF pesa 57 kDa ed ha due sequenze segnale nucleari esposte. In origine la proteina consiste in 2 domini: un dominio redox attivo e un dominio proapoptotico. Quando non è impegnato come fattore apoptotico AIF ha un ruolo accessorio nel processo di fosforilazione ossidativa in atto nei mitocondri delle cellule funzionanti, grazie alla sua attività NADH ossidasi (Ozaki et al., 2009).

Dopo il processamento a tAIF, si può notare dalla Figura 15 come a tAIF venga permesso di uscire dai mitocondri per effetto dell’azione della m-calpaina mitocondriale, attiva solo ad alte concentrazioni di calcio (intorno a 1 mM), con la formazione del canale Bax/VDAC. Dopo l’uscita di tAIF dal mitocondrio esso viene traslocato nel nucleo per effetto delle sequenze segnale di cui è dotato, permettendo così l’inizio del processo di frammentazione del DNA (Ozaki et al., 2009).

Lo studio fatto nell’introduzione sui pathway che regolano la morte cellulare nei fotorecettori permette una migliore comprensione degli articoli che vi presento: il primo prende in esame un’ipotesi di terapia genica da effettuare per eliminare una qualsiasi mutazione nel gene della rodopsina, che potrebbe essere responsabile di una forma autosomica dominante di retinite pigmentosa; il secondo articolo dimostra invece come AIF sia la principale causa della degenerazione retinica nei topi rd1, portanti una mutazione nel gene PDE6B.